基因文库构建的过程、原理及方法
1 cDNA 文库的构建 1.1 cDNA 文库构建的基本原理与方法 cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。经典 cDNA 文库构建的基本原理是用 Oligo(dT) 作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。其基本步骤包括：RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取方法的选择主要根据不同的样品而定)，要构建一个高质量的 cDNA 文库，获得高质量的 mRNA 是至关重要的，所以处理 mRNA 样品时必须仔细小心。由于 RNA 酶存在所有的生物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建立一个无 RNA 酶的环境对于制备优质 RNA 很重要。在获得高质量的
基因工程技术包括一系列的分子生物学操作步骤．请回答下列问题：（1）基因工程操作的核心步骤是
（1）基因工程操作的核心步骤是构建基因表达载体．（2）cDNA文库的构建方法为：某生物某发育时期所转录的全部mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合．（3）限制酶、DNA连接酶和运载体是基因工程的基本操作工具．其中限制酶的特点是能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂．（4）PCR技术中需要的酶是热稳定DNA聚合酶；PCR的原理是DNA分子复制，若PCR进行30轮循环，理论上可获得230个基因片段．（5）将目的基因导入动物受体细胞的方法是显微注射法．（6）分子水平检测抗虫棉基因是否表达的方法为抗原-抗体杂交技术；个体水平鉴定的方法为抗虫接种实验．故答案为：（1）构建基因表达载体（2）某生物某发育时期所转录的全部mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合（3）运载体 能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂（4）热稳定DNA聚合酶
基因组DNA文库和cDNA文库在构建原理和用途上的区别
基因组DNA文库含有一种生物的全部基因,从基因组文库中获得的基因是完整的cDNA文库含有一种生物的部分基因,cDNA本质就是外显子基因组文库大,其中基因含有启动子和内含子cDNA文库小,没有内含子和启动子
cDNA 文库的构建过程中需要高质量RNA,但是提取的RNA质量不高,想得到高质量的RNA其纯化步骤是什么
分离的总RNA可利用mRNA 3'末端含有多聚(A)+ 的特点,当RNA流经oligo (dT)纤维素柱时,在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素上,然后逐渐降低盐浓度洗脱,在低盐溶液或蒸馏水中,mRNA被洗下.经过两次oligo(dT)纤维素柱,可得到较纯的mRNA.详见参考资料
基因工程又称为DNA重组技术，回答相关问题：（1）在基因工程中，获取目的基因主要有两大途径，即
1、基因文库是指将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因．基因组文库包含某种生物所有的基因；部分基因文库包含某种生物的部分基因．如：cDNA文库．2、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法．3、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术．（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等．4、基因表达载体的构建：①过程：用同一种限制酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组DNA分子．②目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用．③基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因